今天若米知识就给我们广大朋友来聊聊实时荧光定量pcr方法,以下关于观点希望能帮助到您找到想要的答案。
实时荧光定量PCR——RT-QPCR
最佳答案目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法
SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：
实验试剂及耗材：
试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA
试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master
1号管包含：
热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2
仪器及耗材：
罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等
正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】
二、反转录
实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
(1)配制NTC对照：（总13ul）
水——10ul
oligo dT引物 ——1ul
随机六聚体引物——2ul
混匀
（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）
总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul
oligo dT引物——1ul
随机六聚体引物——2ul
水——9ul
混匀
【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA】
（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min
（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：
配制总mix（除了RNA模板和引物）
5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）
dNTP mix ——12ul（2ulX6管）
40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）
20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）
mix总体积——42ul（7ulX6管）
若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。
将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：
25℃ 10min
55℃ 30min
85℃ 5min
最后置于冰上停止反应。
此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响
SYBR Green 反应体系的配制：
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析。
实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）
5个反转录样品（包含1个NTC对照【Negative Template Control缩写】）
由于样本数较多，如下配置：
不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）
按照体系配方配制：
2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）
10x Primer mix —— 66ul（2ulX33）
PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）
总体积 ——594ul
用移液枪轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。
标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA，空白对照加入6ul水代替模板，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。
反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。
混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中，用封口膜盖好96孔板。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中
PCR程序设置与运行：
（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面。
（2）点击New Experiment
（3）设置反应体积（对于96孔板，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul
（4）在Program中输入反应名称preincubation，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集
（5）点击增加按钮，输入amplification，定义扩增循环的次数为445次，选择荧光的收集功能Quantification
（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s
（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s
【6.7两步 Analysis Mode默认None】
（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single
（9）设置溶解曲线，在program新的一行中输入Melting curve，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度，再点击增加按钮，65℃ 1min 两步Acquisition Mode默认选择None
（10）点击增加按钮，95℃ Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动
（11）设置保温的过程cooling，1个循环，无需荧光，40℃ 1min
（12）设置完成后，点击右方保存按钮，保存设置的程序
（13）点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
样品编辑
（1）实验结束，点击Sample editor，进入样本编辑程序
（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑，设置阴性对照、空白对照、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔
（3）在Sample Name中输入被选择样品名称
（4）最后点击make replicates设置复孔
（5）标准品设置时，需填写拷贝数、稀释倍数、初始浓度即可
（6）编辑好样品后，可进行数据分析，如有需要，也可进行组间分析
结果分析
（1）点击左下方的SUM，将显示出所有信息，包括设置的反应程序、实验结果分析等。
（2）点击Analysis，可对已有的数据进行细致的分析
（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax，弹出Create new analysis窗口
（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线
（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率、斜率、截距、线性关系以及错误率 （一般error值越小，说明实验准确率越高，扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好）
（6）在数据表格，可显示样本的Cp值，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计，显示Cp平均值、方差，浓度的平均值以及方差
实时荧光定量 PCR
最佳答案 实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。
SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。
因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。
使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。
首先是反转录合成 cDNA 第一链：
实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。
若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。
将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。
若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。
cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。
本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。
本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。
按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。
双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。
在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。
点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。
设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。
设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。
点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。
Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。
在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。
样品编辑好后，可进行实验结果分析。
点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。
点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。
点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。
Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。
扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。
在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。
按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。
实时定量PCR，定义
最佳答案实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。
实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-time RT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
荧光pcr检测原理
最佳答案实时荧光定量PCR
1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
荧光化学物质
目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。
荧光染料
荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
荧光染料的优点：
使用简便；
可以与任何PCR产物结合；
价格便宜；
荧光染料的缺点：
不能区分不同的双链DNA
引物二聚体会影响检测的敏感性
非特异性产物会影响结果的敏感性
引物二聚体和非特异性扩增问题可以通过熔解曲线 (Melting curve) 进行识别，进而通过PCR引物的设计和反应条件的优化得以解决。
总的来说，SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。
荧光探针
Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。
当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。
TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。
TaqMan探针技术的优点：
荧光背景低；
敏感性高；
杂交稳定性高；
荧光光谱分辨率好；
特异性高。
TaqMan探针技术的缺点：
成本高；
设计难度大；
只能用于检测产物长度低于150bp的反应。
由于TaqMan探针的高特异性，可用于等位基因的辨别，特别适用于人类基因多态性以及根据SNP区别和定量菌株。
Real-time qPCR技术的定量原理
扩增曲线
在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。
荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。
在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。
只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
荧光阈值
为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。
通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。
循环阈值
循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。
一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小物差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。
什么是实时荧光定量pcr
最佳答案实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
明白实时荧光定量pcr方法!实时荧光pcr法的一些要点，希望可以给你的生活带来些许便利，如果想要了解其他内容，欢迎点击若米知识的其他栏目。
